新 技 术 提 升 人 类 基 因 组 修 复 效 率
(2005年6月)据 英 国 消 息,利 用 定 制 好 的 DNA 切 割 酶, 研 究 人 员 可 以 大 大 提 高 人 类 细 胞 同 源 重 组 的 概 率, 这 对 基 因 治 疗 具 有 巨 大 的 应 用 潜 力。

通 过 定 向 同 源 重 组, 可 以 改 变 活 细 胞 的 基 因 组 序 列, 进 而 对 整 个 动 物 体 进 行 基 因 重 组, 这 在 生 物 学 上 带 来 了 一 场 革 命。 不 幸 的 是, 尽 管 传 统 的 定 向 策 略 在 小 鼠 胚 胎 干 细 胞 中 非 常 有 效, 但 被 用 于 人 类 时 则 不 尽 人 意, 其 同 源 重 组 率 相 当 低。 其 他 的 替 代 方 法 (如 利 用 病 毒 载 体) 也 有 一 定 效 果, 但 存 在 转 基 因 位 点 不 恰 当, 或 内 源 基 因 序 列 被 破 坏 的 危 险, 这 会 带 来 严 重 的 后 果。

在 双 链 DNA 断 裂 处 同 源 重 组 发 生 的 机 率 非 常 高; 理 论 上 来 说, 如 果 能 准 确 地 选 择 基 因 组 断 裂 区, 则 基 因 定 向 化 可 能 更 加 有 效。 其 中 人 们 熟 知 且 最 具 特 征 的 DNA 结 合 蛋 白 基 元 是 锌 指 状 物, 它 通 过 α - 螺 旋 区 域 识 别 并 结 合 特 定 的 3-4 个 核 苷 酸 序 列, Johns Hopkins 和 Srinivasan Chandrasegaran 的 研 究 表 明, 交 换 具 有 不 同 特 性 的 锌 指 状 物 区 域, 可 以 改 变 核 酸 酶 的 定 向 性。 Utah 大 学 的 Dana Carroll 和 德 克 萨 斯 大 学 西 南 医 学 中 心 的 Matthew Porteus, 对 该 项 工 作 进 行 了 更 进 一 步 研 究, 即 利 用 嵌 合 的 锌 指 状 物 核 酸 酶 (ZFNs) 刺 激 青 蛙、 果 蝇 和 人 类 细 胞 进 行 同 源 重 组 (Bibikova 等 人, 2003; Porteus 和 Baltimore,2003)。

通 过 与 Porteus 进 行 合 作, Michael Holmes 和 他 在 Sangamo 生 物 科 学 公 司 (位 于 美 国 加 利 福 尼 亚 洲 的 Richmond) 的 同 事 着 手 改 进 这 一 技 术, 同 时 也 是 为 了 寻 求 新 的 基 因 治 疗 方 法。 “事 实 上, 我 们 可 以 将 锌 指 状 物 定 位 到 基 因 组 的 任 何 序 列 中,” Holmes 说, “并 且, 我 们 可 以 用 具 有 3 个、 4 个 或 6 个 锌 指 状 物 的 区 域 来 完 成 这 项 工 作, 这 可 以 使 我 们 了 解 可 识 别 9 个、 12 个 或 18 个 碱 基 对 的 区 域 的 基 本 特 征。” 为 了 进 行 切 割, 两 个 锌 指 状 物 核 酸 酶 必 须 同 时 起 作 用 : 两 个 酶 分 别 与 目 标 两 侧 的 位 点 结 合, 再 进 行 切 割, 然 后 染 色 体 和 “供 体” DNA 分 子 之 间 进 行 同 源 重 组, 从 而 改 变 染 色 体 的 基 因 序 列。

利 用 人 类 红 白 血 病 K562 细 胞 进 行 试 验, 研 究 小 组 发 现 了 IL2RG 基 因, 该 基 因 导 致 X 连 接 严 重 结 合 免 疫 缺 陷 (SCID)。 利 用 最 适 合 的 锌 指 状 物 核 酸 酶 来 调 节 沉 默 点 突 变 体 的 导 入, 研 究 人 员 将 同 源 重 组 率 提 高 到 21%。 经 过 一 段 时 间 后, 同 源 重 组 率 仍 然 稳 定, 甚 至 在 一 个 月 之 后, 被 改 变 基 因 的 细 胞 相 对 比 例 仍 然 保 持 不 变。 第 二 轮 的 试 验 结 果 表 明, 在 处 理 的 细 胞 中, 内 源 等 位 基 因 位 点 被 修 饰 的 细 胞 占 6.6%。 适 当 降 低 杂 合 和 纯 合 突 变 体 中 可 检 测 的 mRNA 和 蛋 白 质 水 平, 这 一 试 验 技 术 也 可 被 用 于 将 结 构 改 变 的 杂 合 和 纯 合 突 变 体 导 入 到 相 同 基 因 中。 该 研 究 小 组 声 称, 他 们 研 制 的 锌 指 状 物 核 酸 酶 既 可 调 节 点 突 变 体 的 导 入, 也 可 调 节 大 序 列 片 断 的 导 入。

在 阐 明 高 效 定 向 双 等 位 基 因 修 饰 的 可 行 性 之 后, Holmes 指 出, 他 的 研 究 小 组 现 正 在 着 力 改 善 这 一 试 验 系 统 的 实 际 应 用 性。 “我 想 我 们 的 短 期 目 标 是 构 建 更 好 的 载 体 系 统, 以 使 我 们 能 将 我 们 的 核 酸 酶 和 供 体 分 子 导 入 到 一 些 重 要 的 分 子 中, 比 如 T 细 胞 和 干 细 胞, 并 使 这 项 技 术 既 可 以 用 于 动 物 研 究, 必 要 时 也 可 用 于 临 床 试 验。” 这 项 技 术 可 能 对 基 因 治 疗 的 应 用 具 有 重 要 作 用, 用 于 动 物 实 验 的 初 步 计 划 已 在 进 行 中。 “我 们 正 在 计 划 利 用 动 物 实 验 进 行 X 连 接 SCID 项 目, 我 们 认 为, 另 外 一 个 项 目 可 能 在 不 久 的 将 来 对 临 床 试 验 具 有 非 常 大 的 潜 力, 那 就 是 以 CCR5 为 目 标, 对 CCR5 进 行 修 饰, 来 增 加 细 胞 抵 抗 HIV 感 染 的 抗 性。”
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